Flemish Red e Oud Bruin

Le flemish red e le oud bruin sono delle birre fiamminghe acide che però non fermentano spontaneamente. Infatti, l'acidità l'acquistano nel tempo con l'invecchiamento. Mentre un'altra differenza sta nei malti e nei cereali impiegati per l'ammostamento, infatti, non viene utilizzato il frumento, ma mais, tra il 10 e il 20% in base allo stile. E diversi malti tostati per dare colore e carattere alla birra.

Per una maggiore comprensione geografica parlerò delle Fiandre. Queste sono una delle tre regioni che compongono il Belgio. Si trovano nella parte settentrionale del paese e in esse si trova la regione di Bruxelles-Capitale. 

Mentre si suddividono (da ovest verso est) nelle seguenti province: Fiandre occidentali, Fiandre orientali, Anversa, Brambate fiammingo e Limburgo, come è possibile vedere nell'immagine sopra [1].

Flemish red

Questo stile viene prodotto nelle Fiandre occidentali. Le birre appartenenti a questo stile si presentano di colore che va dal rosso-bruno al bordeaux, dato dall'utilizzo di malti moderatamente tostati; tanto da essere spesso chiamate "Borgogna di Belgio. La birra presenta sentori fruttati (frutta rossa), insieme a note di vaniglia, spezie e madeira, date dall'invecchiamento in botte.

Un grado iniziale tra 12 e 14 °P, con un'attenuazione apparente che può arrivare fino al 98%. E che porta ad avere 0.5 - 3.0 °P finali e 4.6 - 6.5 % ABV. Mentre il grado di amarezza è compreso tra 10 e 25 IBU, dati luppoli europei a basso contenuto di alfa acidi.

Come detto la sua produzione parte da malti base uniti a quelli moderatamente tostati e luppoli europei o inglesi. Alcuni produttori tendono invece a miscelare un mosto di solo malto pilsner con della birra scura prima dell'imbottigliamento (che ne accentua i sentori di invecchiamento).

La fermentazione può avvenire ad opera di un solo ceppo di lievito oppure di una miscela di lieviti e batteria. Mentre dopo la fermentazione primaria, la birra viene fatta acidificare in botti di rovere per un periodo che può durare fino a tre anni. Nelle quali tende a scurirsi per via del contatto con il legno e ad una lenta ossidazione.

Il carattere tipico di questo stile si sviluppa durante la lunga maturazione in botte, dove i microrganismi in esse contenute contribuiscono a ciò. Questo è dato dalla naturale porosità del legno. Come con il lambic, per garantire una qualità uniforme e una complessità viene tagliato con altre birre.

Oud bruin

Questo stile viene prodotto nelle Fiandre orientali. Le cui birre si presentano di colore rossiccio-bruno. Dai sentori fruttati (frutta a nocciolo e frutta secca) e maltati.

Un grado iniziale tra 10 e 18 °P, con un'attenuazione apparente del 80%. E che porta ad avere 2 - 3 °P finali e 4 - 8 % ABV. Mentre il grado di amarezza è di 25 IBU, dati luppoli europei a basso contenuto di alfa acidi.

Già ad una prima analisi queste birre sono molto differenti rispetto le Flemish Red, più scure e con l'amaro quasi il doppio, sebbene i malti impiegati le rendono più dolci. Vengono fatte fermentare con colture miste di lieviti e batteri, ma invecchiate in tini di acciaio. Questi presentano molti vantaggi, infatti, hanno bisogno di meno cure e manutenzioni rispetto alle botti in rovere, benché la birra risultante sarà diversa. E il suo punto di forza sta in ciò.

I serbatoi d'acciaio riscaldati permettono l'acidificazione della birra, essendo i batteri più dominati in fermentazione generano sottoprodotti differenti rispetto le cugine rosse. Così da avere un carattere aspro e vinoso di queste birre coperto da quello dolce e maltato della birra giovane.

Per questo motivo le Oud Bruin presentano un'acidità prettamente lattica, visto che i tini in acciaio non permettono la permeazione dell'ossigeno. Invece, le Flemish Red presentano un acidità acetica data dalla permeabilità delle botti.

Sitografia

[1] https://www.treccani.it/enciclopedia/belgio_res-2ae17190-a825-11e2-9d1b-00271042e8d9_%28Atlante-Geopolitico%29/

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Lambic

Originario del circondario di Bruxelles, il Lambic è tra i pochi stili esistenti a fermentazione spontanea, cioè l'inoculo dei microrganismi necessari per la sua fermentazione avviene naturalmente, senza che vi sia la mano dell'uomo. Nonché uno tra gli stili di birra acida più conosciuto.

Biére de mars, Faro e Lambick

In passato queste tre birre erano strettamente legate. Esse si producevano ammostando malto d'orzo e frumento (crudo) in egual quantità, insieme a pula di frumento (per migliorare la filtrazione). Dove l'ammostamento si aveva con l'aggiunta inizialmente di acqua fredda e successivamente di acqua bollente. 

Dal primo mosto, quello dato dall'ammostamento e quindi più zuccherino si andava a produrre il Lambick, che aveva un grado iniziale di 7-8°Bé (12.7-14.5°Br), e a fine fermentazione 2-3°Bé. Si trattava di una birra adatta alla lunga conservazione, la quale veniva effettuata in botti. 

Dal secondo mosto, quello derivato al lavaggio delle trebbie, povero di zuccheri. Si andava a produrre la Biére de mars, con un grado iniziale di 3°Bé (5.5°Br). Era una birra leggera adatta al consumo immediato.

Queste due birre si producevano in egual quantità a partire dalla medesima cotta di cereali. E mescolandole insieme si andava a generare il Faro. Quest'ultima tipologia, solitamente si andava preparando dall'unione in egual parte delle due birre sopra citate, già fermentate. Raramente dai due mosti, i quali dovevano risultare in un mosto approssimativamente da 5°Bé (9.1°Br), e fatta fermentare allo stesso modo di queste [1].

La fermentazione di queste birre avveniva nel periodo invernale, ed era spontanea, il che portava all'ottenimento a lungo andare di un prodotto acido, oppure con odori sgradevoli, nonostante si utilizzasse si utilizzasse del luppolo fresco, come si può vedere sopra [1].

Turbid mash

Il lambic prende nome dalla città di Lembeek, e si hanno notizie della sua produzione sin dal 1320. Ma quello che viene prodotto oggi, nasce agli inizi dell'800, perché la sua particolarità non sta solo nel come viene fermentata, ma anche per come viene ammostata. 

Ciò è causata da una legge olandese del 1820 (il Belgio dichiarò la sua indipendenza dai Paesi Bassi nel 1830), la quale tassava i birrifici in base al volume dei tini di ammostamento, con una scappatoia sui cereali non maltati che venivano ammostati separatamente (abolita nel 1885). Da qui nascono tecniche di ammostamento che prevedevano un tino di ammostamento e uno di gelatinizzazione dei non maltati, dove si prendeva parte del mosto del primo per ammostare il secondo.

Successivamente si venne a creare quello che oggi è conosciuto come turbid mash  o ammostamento torbido, che vede l'aggiunta di acqua calda alla miscela di grani, e lo spillamento del successivo mosto, per fare spazio all'aggiunta della nuova acqua.

Per semplificare il tutto ho riportato il seguente schema sulla sinistra, gentilmente preso dal sito: eurekabrewing.wordpress.com

Come si può vedere sono necessari tre tini, uno per l'acqua calda, uno per l'ammostamento dei cereali, e il terzo per l'ammostamento del mosto torbido.

Il risultato di tutto questo processo è quello di un mosto torbido, parzialmente saccarificato, le cui destrine ed amidi porteranno ad un lunga e lenta fermentazione da pare di lieviti selvatici e brettranomyces.

Luppolo invecchiato

Seconda particolarità del lambic è l'utilizzo in bollitura di luppolo invecchiato. L'utilizzo di quello fresco risulterebbe troppo batteriostatico per permettere la fermentazione lattica successiva a quella alcolica. Come riportato nello schema sottostante [2].

Poiché gli alfa acidi del luppolo isomerizzati in bollitura tendono a con il tempo a degradarsi, oltre ad essere sensibili al pH. Allora ci vengono in aiuto i beta acidi, che sono presenti in quantità inferiore (solitamente la metà di quelli alfa) nei luppoli, e una volta ossidati (con l'invecchiamento), sono solubili e con una buona stabilità apportano un grado di amarezza. Questo tipo di ingrediente lo si produce lasciando invecchiare per almeno tre anni il luppolo in balle, in modo che sia alfa che beta acidi si ossidano. 

La bollitura del lambic prevede una durata che va dalle 4 alle 6 ore, anche se tradizionalmente si procedeva con un sobbollita di almeno 12 ore. Mentre per tutto il tempo di ebollizione si mettono in infusione 5.6g/l di luppolo invecchiato per la luppolatura.

L'inoculo

Terminata la bollitura, il mosto viene inviato alle camere di raffreddamento, nelle quali sono presenti delle larghe vasche, chiamate koelschip, atte a questo processo. Qui il mosto caldo viene versato, e nel mentre filtrato dal luppolo, lasciandolo raffreddare per una notte.

Le vasche tradizionalmente in rame (a sinistra [4]), ma ve ne sono di moderne in acciaio inossidabile, presentano un rapporto superficie/volume di mosto che va da 0.14 a 0.58 1/dm. Il che significa che ad esempio per una cotta da 25.0l servirà una superficie che va da 3.5 a 14.5 dmq, quindi una pentola con un diametro da 3.5dm (9.6dmq) è un buon compromesso.

Nelle camere di raffreddamento sono presenti delle finestre per il ricambio dell'aria. E che tradizionalmente fungevano da inoculo, infatti, intorno ai birrifici, così come lungo tutta la valle della Senna, venivano coltivati i ciliegi Schaarbeek, i quali contribuivano in maniera naturale per l'inoculo del mosto. Mentre oggi queste camere vengono bagnate con del lambic maturo, per mantenere un a buona flora microbica in essa.

L'invecchiamento

Il mosto del lambic dopo essere stato raffreddato, viene spostato nel tino di fermentazione primaria, detto anche "horny tank", dove appunto fermenta e vi ci rimane per tutta la durata della fermentazione, circa tre o quattro mesi. 

Dopo di che per essere un vero lambic, esso deve invecchiare in botte per almeno tre anni, come detto precedentemente questo stile era destinato alla lunga conservazione. Ma il fatto che fermentasse spontaneamente lo rendeva instabile nel tempo, inacidendo, e questo è diventato il suo punto di forza oggi. 

Durante la sua maturazione in botte, il lambic passa dal sembrare una weizenbier, ad acquisire acidità, data dalla fermentazione lattica, e sentori vinosi dati dai brettanomyces. Un altro contributo dato da quest'ultimi è l'acidità acetica, poiché attraverso il legno delle botti permea ossigena, andando ad ossidare la birra.

Al termine di questa maturazione il lambic, viene blendato, cioè miscelato con altri lambic, nella stessa maniera con la quale si fa con i vini francesi. Al fine di garantire un prodotto costante.

La famiglia del lambic

Esistono diverse varianti del lambic, influenzati da come vengono lavorate e da cosa viene aggiunto. Il lambic puro, si presenta come una birra secca, acida e dai sentori funky. Essa non viene rifermentata in bottiglia, quindi la si serve liscia, ed può assomigliare ad un vino bianco.

Per mitigare la sua acidità, al momento in cui viene servita vi si aggiunge dello zucchero. Si ha così il faro, il quale come si può leggere sopra era una versione leggera del lambic di una volta. Mentre oggi appunto è la sua versione addolcita.

"I lambic, le birre alla frutta e le gueuze dolci non esistono. È impossibile. Se sono dolci, i casi sono tre: non sono lambic, contengono aspartame o sono stati pastorizzati. Il lambic è un prodotto naturale"

Jean-Paul Van Roy di Brasserie-Brouwerij Cantillon

Appunto, come si sa, se si aggiunge zucchero ad una birra non pastorizzata essa poco dopo tenderà a fermentare. Il faro lo si fa al momento del servizio, mentre alcuni produttori di lambic, per renderla più appetibile, gli aggiungono dolcificanti non fermentabili come aspartame o saccarina.

Un altro modo per mitigare il lambic è quello di aggiungere della frutta, e lo si fa direttamente in botte dopo uno oppure due anni da quando è stato trasferito in esso. Con un dosaggio di 2-3kg/l, ciò porta ad avvio della fermentazione, per via degli zuccheri contenuti nella frutta. Essa vi rimane tra i sei e i nove mesi, fino alla sua completa fermentazione. In passato la frutta veniva aggiunta sotto forma di succo al momento in cui veniva servita, per mitigare la sua acidità, poi col tempo si è iniziati a metterla in maturazione.

Tradizionalmente come frutta si utilizzano le ciliegie, come detto prima molto coltivate nella zona di produzione del lambic, e si ha così il kriek (ciliegia in belga) o kriek lambic. Mentre durante lo scorso secolo si è iniziati ad aggiungere altra frutta, inizialmente lamponi, per avere così la framboise o framboise lambic, e in seguito l'uva, druivenbier o druiven lambic. Mentre dagli anni '80 in poi i produttori hanno iniziato a sbizzarrirsi, andando a aggiungere pesche, ribes nero, albicocche e fragole.

Ultima variante del lambic è il gueuze, prodotto miscelando lambic giovane (un anno in botte) con lambic vecchi, in proporzioni varie:

• 50% lambic di un anno, 25% lambic di due anni e 25% di tre anni;
• 67% lambic di un anno e 33% lambic di due o tre anni;
• 95% lambic di due anni e 5% lambic che ha fermentato per qualche settimana.

Questo blending, permette al lambic, di avviare una seconda fermentazione, la quale lo andrà rendere frizzante durante la sua maturazione in bottiglia. Infatti, questo stile non viene conservato in botte, ma in bottiglia, le quali vengono poste in orizzontale (immagine sopra [3]), e mantengono questa posizione anche quando vengono servite, poiché i lieviti si andranno a depositare lungo la bottiglia.

Bibliografia

[1] La Cambre, G.; Traité Complet de la Fabrication des Bières, et de la Distillation de Grain, Pomme de Terre, Betteraves, Topinambours, etc.; Tome Premier, Bruxelles, 1856;

[2] van Oevelen et al; Microbiological aspects of spontaneous wort fermentation in the production of lambic and gueuze, 1977;

[3] https://www.flickr.com/photos/13264649@N05/2141004100/

[4] https://www.flickr.com/photos/brostad/14270094022/in/photolist-nsG1rr-iLKUK7-a38poq-em6LsW-nKbDBT-nJTB8p-nJZXMQ-dSvjJN-nsG1kV-2euruKp-nH99uG-8ojvE9-2hpjmN8-7TWDfz-7tz5KX-nKbDuP-9DGjYC-9NsqDB-kKKyuD-9R1oDG-3rQ288-neoiYd-nmpVRu-rWRwAn-j6vdFV-efyNt2-2hbjhVT-p8gZGd-2kCBZSo-efEy77-9YThw7-qSDk4L-hZCW9q-48fyTq-dXTwie-dXZcvu-nmpWaL-jgaSZj-i26WuH-nynbW7-eoZT2Q-eoZRNW-eoZUb9-p8gZUh-rWJibs-efEycd-feUY6S-2kCBsnt-2kCBZUY-eH886z/

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Fermentazione acido-mista

La fermentazione acido-mista è una processo metabolico impiegato principalmente da batteri appartenenti alla famiglia degli enterobacteriaceae come gli escherichia coli; questi per ricavare energia dai carboidrati producono vari sottoprodotti come etanolo, acido formico, acido acetico, acido lattico e acido succinico, dove i vari percorsi sono riassunti nell'immagine sottostante [2].

Come sempre alla base di tutto c'è la glicolisi che scinde il glucosio in piruvato, producendo ATP e NADH-H+ che deve essere rigenerata.

Glucosio => 2Piruvato + 2NADH-H+ + 2ATP

Il piruvato prodotto può prendere diverse vie in base alla quantità di NADH-H+ da rinnovare e si avranno così le seguenti possibilità:

Via lattica

Altro non è che quella omolattica, con formazione di acido lattico:

Piruvato + NADH-H+ => Lattato + NAD+

Via formica

Non essendo presente il complesso enzimatico del piruvato deidrogenasi (PDH), il piruvato viene convertito in acetil-CoA attraverso l'enzima piruvato-formiato liasi (PFL), che come lascia intendere produce formiato come prodotto secondario.

Piruvato + CoA => Acetil-CoA + Formiato

Il formiato prodotto a sua volta viene scomposto in anidride carbonica e idrogeno per mezzo dell'enzima formico idrogenasi, utilizzato principalmente per evitare che all'interno della cellula il pH si abbassi troppo.

Formiato => CO2 + H2

Ne consegue che nel complesso la via metabolica assume la seguente reazione:

Piruvato + CoA => Acetil-CoA + CO2 + H2

Via etanolica

Simile a quella utilizzata dai lieviti, con la differenza che si utilizza l'acetil-CoA, il quale viene inizialmente idrogenato in acetaldeide e a sua volta idrogenata ancora in etanolo.

Acetil-CoA + NADH-H+ => Acetaldeide + CoA + NAD+

Acetaldeide + NADH-H+ => Etanolo + NAD+

Via acetica

Un'altra sorte dell'acetil-CoA è quella di divenire acido acetico con la sintesi di ulteriore ATP, nel seguente modo:

Acetil-CoA + Pi => Acetil-Pi + CoA

Acetil-Pi + ADP => Acetato + ATP

Via succinica

Infine, si ha la via della produzione di acido succinico. Per questa si parte da un prodotto intermedio della glicolisi che è il fosfoenolpiruvato (PEP) che viene carbossilato per mezzo dell'enzima fosfoenolpiruvato carbossilasi, per avere ossalacetato, il quale segue aritroso un parziale ciclo di Krebs per la produzione di succinato e la rigenerazione della NADH-H+

Fosfoenolpiruvato + HCO3- => Ossalacetato + Pi

Ossalacetato + NADH-H+ => Malato + NAD+

Malato => Fumato + H2O

Fumato + NADH-H+ => Succinato + NAD+

Globalmente la reazione sarà:

Fosfoenolpiruvato + HCO3- + 2NADH-H+ => Succinato + Pi + H2O + 2NAD+

Conclusione

La combinazione di queste vie porta alla produzione in media di 2.5 molecole di ATP per ognuna di glucosio. Quindi una possibile combinazione è la seguente:

2Glucosio + 5(ADP + Pi) => CO2 + H2 + Formiato + Acetato + Etanolo + 2Lattato + 5(ATP + H2O)

Dove il rapporto di molecole acide su quelle neutre deve essere di 4:1, e quella di CO2 e H2 deve essere di 1:1 [1].

Bibliografia

[1] Ciani M., Comitini F, e Mannazzu I; Fermentation; Encyclopedia of Ecology, Volume 2, 2013, Pages 310-321;

[2] Metabolismo microbico: concetto di fermentazione. Esempi di fermentazioni degli zuccheri e degli aminoacidi

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Fermentazione lattica

Un'altra glicolisi anaerobica è la fermentazione lattica, processo metabolico anaerobico di cui si servono molti microrganismi per ricavare energia dai carboidrati, producendo come sottoprodotto l'acido lattico, ossiacido in grado di inibire molti batteri patogeni e il quale è alla base di ogni bevanda fermentata acida.

C6H12O6 => 2C3H6O3 (+ energia)

Le specie che si servono di questa fermentazione sono soprattutto i batteri lattici (LAB), batteri anaerobici aerotolleranti dell'ordine dei lactobacillales, al quale appartengono i generi dei lactobacillus, dei leuconostoc, degli oenococcus e dei pedioococcus. Degno di nota è anche lo streptococcus thermophilus che insieme al l. delbrueckii subsp. bulgaricus, viene utilizzato nell'industria casearia per la produzione di yogurt.

Fermentazione omolattica

Per fermentazione lattica in senso stretto si intende quella omolattica, nella quale viene prodotto solo acido lattico. I lattobacilli che utilizzano questa via metabolica sono chiamati omofermentativi obbligati e sono i seguenti: l. acidophilus, l. delbrueckii, l. helveticus, l. malis, l. salivarius e s. thermophilus.

Alla base di questa fermentazione vi è la glicolisi, processo di scissione dei carboidrati in piruvato, la cui reazione è stata riassunta sottostante.

Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi => 2Piruvato + 2NADH-H+ + 2ATP + 2H2O

Ma essendo la fermentazione anaerobica, di conseguenza avviene in assenza di ossigeno, come agente riducente del NADH-H+ si utilizza lo stesso piruvato prodotto dalla glicolisi, che viene convertito in lattato, come nell'immagine sopra [3].

Piruvato + NADH-H+ => Lattato + NAD+

Quindi l'intera fermentazione può essere riassunto nel seguente modo:

Glucosio + 2ADP + 2Pi => 2Lattato + 2ATP + 2H2O

Questa fermentazione è molto simile a quella alcolica dei lieviti, dove l'unica differenza sta nei prodotti. Esse vengono raggruppate nel percorso di Embden-Meyerhof, illustrata nell'immagine sottostante [5].

Fermentazione eterolattica

La maggior parte dei lattobacilli, però, quando fermenta non produce solo esclusivamente acido lattico, ma può produrre etanolo, acido acetico, acido formico e tutta una serie di sottoprodotti. Oltre a ciò sono in grado di fermentare sia gli esosi (glucosio, galattosio e fruttosio) che i pentosi (ribosio e xilosio).

Essendo la fermentazione mista, si parla di fermentazione eterolattica, la quale viene utilizzata da due gruppi di lattobacilli: gli eterofermentanti facoltativi, i quali se il substrato di cui si alimentano è ricco di zuccheri, fermentano omolatticamente, altrimenti in carenza di questi tendono a fermentare eterolatticamente, i lattobacilli appartenenti a questo gruppo sono i seguenti: l. casei, l. curvatus, l. paracasei, l. pentosus, l. plantarum, l. sakei; l'altro gruppo di lattobacilli sono gli eterofermentanti obbligati, che danno come prodotto di fermentazione esclusivamente acido lattico, etanolo e/o acido acetico, ad appartenere a questo gruppo sono i seguenti lattobacilli: l. brevis, l. buchneri, l. collinoides, l. fermentum, l. fructivorans, l. hilgardii, l. reuteri.

Il motivo per il quale questi batteri fermentando, producono oltre al lattato anche l'etanolo, risiede nella loro flessibilità di fermentare anche i pentosi. Infatti, nella scissione dei carboidrati non seguono la glicolisi, ma utilizzano la via dei pentosi fosfati unita alla fosfochetolasi

Infatti, una volta formato lo xilulosio-5-fosfato esso viene scisso dalla fosfochetolasi in gliceraldeide-3-fosfato e in acetil-fosfato, che andranno a formare rispettivamente lattato ed etanolo, come nell'immagine sottostante [4].

Viene utilizzata questa via metabolica, poiché gli eterofermentanti obbligatori non hanno l'enzima aldolasi che nella glicolisi scinde il fruttosio-1,6-difosfato in gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiaceto fosfato. Mentre gli eterofermentanti facoltativi utilizzano normalmente la glicolisi e la via dei pentosi fosfati solo in determinati casi. 

• Glucosio + ATP + 2NAD+ + Pi => 

Gliceraldeide-3-fosfato + Acetil-fosfato + ADP + 2NADH-H+ + CO2

• Acetil-fosfato + 2NADH-H+ => Etanolo + 2NAD+ + Pi
• Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP + Pi => Lattato + 2ATP + H2O

Osservando sopra, la reazione di fermentazione eterolattica, convoglia gli NADH-H+ dalla via dei pentosi fosfati per ossidare l'acetil-fosfato e produrre etanolo, mentre quello derivato dalla conversione di gliceraldeide-3-fosfato in piruvato per ossidare questo e produrre lattato. Tutto ciò, partendo dal glucosio, si può riassumere nel seguente modo:

Glucosio + ADP + Pi => Lattato + Etanolo + CO2 + ATP + H2O

Mentre partendo dai pentosi come il ribosio, si ha:

Ribosio + ADP + Pi => Lattato + Etanolo + ATP + H2O

A conti fanti questo tipo di fermentazione dal punto di visto energetico rende pochissimo, una sola molecola di ATP per molecola di glucosio o ribosio. Ma il suo svantaggio è compensato con la possibilità di fermentare pentosi ed avere accesso a fonti energetiche diverse dagli esosi standard.

Fermentazione lattica bifidobatteri

I batteri appartenenti al genere bifidobacterium, fermentano i carboidrati eterolatticamente utilizzando una via di fosfatazione particolare, che produce acido acetico ed acido lattico, come nell'immagine sottostante [1].

Il processo vede due molecole di glucosio, le quali vendono convertite in due di fruttosio-6-fosfato come nella glicolisi, successivamente una di queste viene scomposta in acetil-fosfato ed eritrosio-4-fosfato, il quale viene addizionato all'altra molecola di fruttosio-6-fosfato e scomposta in triosio-fosfato ed eptosio-fosfato. Infine, queste serviranno a produrre due molecole di acetil-fosfato e due di gliceraldeide-3-fosfato.

2Glucosio + 2ATP + 3Pi => 3Acetil-fosfato + 2Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP

Il destino dell'acetaldeide-fosfato è quello di diventare acetato, mentre quello del gliceraldeide-3-fosfato segue lo stesso processo della fermentazione omolattica, quindi diventare inizialmente piruvato e successivamente lattato:

Acetil-fosfato + ADP => Acetato + ATP + H2O

Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP + 2Pi => Lattato + 2ATP + 2H2O

Quindi l'intero processo è molto vantaggioso poiché rende 2.5 molecole di ATP per ognuna di glucosio, come nella seguente reazione globale:

2Glucosio + 5(ADP + Pi) => 3Acetato + 2Lattato + 5(ATP + H2O)

Fermentazione acetica dei lattobacilli

Come detto all'inizio i lattobacilli sono batteri anaerobici aerotolleranti, cioè non riescono ad elaborare l'ossigeno ma ne tollerano la sua presenza. Questo perché non possiedono la catena di trasporto degli elettroni, però possono rigenerare la NADH-H+ riducendo l'ossigeno in acqua o perossido d'idrogeno.

Nell'immagine sopra [2], sono riportare le varie vie metaboliche del l. plantarum e si osserva che il destino del piruvato può essere molteplice.

Via acetica

Il piruvato viene ossidato dall'enzima piruvato ossidasi (POX) in acetilfosfato, il quale a sua volta attraverso l'acetato chinasi (AK) convertito in acetato con produzione di ATP.

Piruvate + H2O + O2 + ADP + Pi => Acetato + CO2 + H2O2 + ATP

Oppure il piruvato decarbossilato dall'enzima piruvato deidrogenasi (PDH) in acetil-CoA, il quale viene fosfato attraverso la fosfotransacetilasi (PTA) in acetilfosfato e produzione di acetato e ATP.

Piruvate + NAD+ + ADP + Pi => Acetato + CO2 + NADH-H+ + ATP

Via aceto-formica

In questo caso il piruvato viene decarbossilato dal piruvato formato liasi (PFL) in acetil-CoA con produzione di formato, e da qui proseguire con la via precedente.

Piruvate + ADP + Pi => Acetato + Formato + ATP

Rigenazione NADH-H+

In presenza di ossigeno da ridurre, ma non disponendo di una catena di trasporto degli elettroni, la NADH-H+ viene rigenerato attraverso due enzimi: la NADH ossidasi (NOX) e la NADH perossidasi (NPR). Le quali utilizzano rispettivamente le seguenti reazioni:

NADH-H+ + O2 => NAD+ + H2O2

NADH-H+ + H2O2 => NAD+ + 2H2O

Questa via metabolica permette a un eterofermetativo di ricavare almeno tre molecole di ATP per molecola di glucosio. Secondo le seguenti reazioni:

Glucosio + 2H2O + O2 + 3ADP + 3Pi => 2Acetato + 2CO2 + H2O2 + 3NADH-H+ + 3(ATP + H2O)

che riassunto diventa:

Glucosio + 2O2 + 3ADP + 3Pi => 2Acetato + 2CO2 + 4H2O + 3(ATP + H2O)

oppure si potrebbe avere:

Glucosio + 2O2 +  3ADP + 3Pi => 2Acetato + Formato + CO2 + H2O2 + 3(ATP + H2O)

Esistono diverse combinazioni di percorsi metabolici, atti a massimizzare la produzione di ATP, ma quelli illustrati sopra in linea di massima sono i più frequenti, da cui si evince che serve ossigeno affinché ciò avvenga, e da cui si capisce che queste non sono vere e proprie fermentazioni, ma come con quella acetica si ha una respirazione.

Bibliografia

[1] Ciani M., Comitini F, e Mannazzu I; Fermentation; Encyclopedia of Ecology, Volume 2, 2013, Pages 310-321;

[2] Quatravaux S., Remize F., Bryckaert E., Colavizza D. and Guzzo J.; Examination of Lactobacillus plantarum lactate metabolism side effects in relation to the modulation of aeration parameters; Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072

[3] https://library.weschool.com/lezione/come-la-cellula-fermenta-zucchero-ad-alcol-e-acido-lattico-4307.html

[4] http://www.biosciencenotes.com/heterolactic-phosphoketolase-pathway/

[5] https://textbookofbacteriology.net/metabolism_3.html

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Fermentazione acetica

Se una bevanda alcolica prende aria si sa, diventa aceto, questo fenomeno è causato dalla fermentazione acetica, processo metabolico aerobico, che ossida l'etanolo in acido acetico, semplice acido carbossilico. Questa fermentazione viene utilizzata principalmente dai batteri appartenenti alla famiglia degli acetobacteraceae, ma può essere utilizzata dai brettanomyces o da alcuni lattobacilli.

C2H6O + O2 => C2H4O2 + H2O + (energia)

Chiamarla fermentazione è un termine improprio in quanto la produzione di acido acetico avviene per ossidazione dell'etanolo e riduzione dell'ossigeno, come con la respirazione o meglio con la glicolisi aerobica.

Nell'immagine sovrastante [4], è illustrato l'intero processo di fermentazione acetica, che inizia con la deidrogenazione dell'etanolo in acetaldeide ad opera del nostro caro alcool deidrogenasi e la riduzione del PQQ in PQQH2. Questa è la pirrochinolina chinone (pyrroloquinoline quinone) un cofattore redox utilizzato dai batteri per la deidrogenazione e quindi l'ossidazione delle sostanze, in pratica lavora alla stessa maniera della NAD+. 

Dopo la produzione di acetaldeide, questa viene idratata e successivamente ossidata ad acido acetico, per opera dell'acetaldeide deidrogenasi con l'ausilio della PQQ. L'intera reazione di ossidazione si può riassumere nel seguente modo:

Etanolo + 2PQQ + H2O => Acido Acetico + 2PQQH2

Mentre la rigenerazione della PQQ avviene lungo la catena di fosforilazione ossidativa, seguendo la reazione:

PQQH2 + 1/2O2 + 3ADP + 3Pi => PQQ+ + 3ATP + 4H2O

Di conseguenza l'intero processo si può riassumere nel seguente modo:

Etanolo + O2 + 6ADP + 6Pi => Acido Acetico + H2O + 6(ATP + H2O)

A conti fatti questa via metabolica è molto vantaggiosa in quanto per ogni molecola di etanolo se ne producono sei di ATP, ma implica la presenza di ossigeno; ecco perché sia vino che birra se vengono arieggiati troppo possono acquisire lo spunto acetico.

Le altre vie metaboliche degli acetobatteri

Gli acetobatteri non ricavano energia esclusivamente dall'etanolo, in quanto non è facilmente reperibile in natura, ma possono utilizzare come fonte tutta una serie di carboidrati come gli esosi (glucosio e fruttosio) e i pentosi (ribosio e xilosio). Questo perché non li scindono attraverso la glicolisi, bensì, utilizzano come la maggior parte dei batteri, la via dei pentosi fosfati 

Questa via metabolica, illustrata sopra [5], è composta da due fasi. Una ossidativa, a sua volta composta da tre passaggi enzimatici atti a convertire gli esosi in pentosi fosfati; mentre l'altra fase è non-ossidativa, composta da una serie di passaggi enzimatici che permette di avere dal ribulosio-5-fosfato gliceraldeide-3-fosfato e fruttosio-6-fosfato e viceversa.

Quindi la prima fase si potrà riassumere con la seguente reazione:

Glucosio-6-fosfato + 2NADP+ + H2O  => Ribulosio-5-fosfato + 2NADPH-H+ + CO2

Mentre la seconda può essere riassunta nel seguente modo:

3Ribulosio-5-fosfato <=> 

Ribosio-5-fosfato + 2Xilulosio-5-fosfato <=> 

Gliceraldeide-3-fosfato + 2Fruttosio-6-fosfato

In questo processo appare un nuovo cofattore redox la NADP+ (nicotinammina adenin dinucleotide fosfato), la quale si riduce in NADPH-H+ quando deidrogena una molecola, lavorando allo stesso modo della NAD+.

Comunque la via dei pentosi viene utilizzata dagli acetobatteri per la produzione dai carboidrati di gliceraldeide-6-fosfato, come con la glicolisi, e da esso produrre piruvato che andrà ad alimentare il ciclo dell'acido citrico (TCA cycle), come con la respirazione aerobica. 

L'intero processo metabolico di questi batteri è riassunto nell'immagine sottostante [2].

In tutto questo splendido meccanismo c'è un intoppo, se il substrato di crescita degli acetobatteri è ricco di etanolo, gli enzimi che permettono il ciclo dell'acido citrico non vengono sintetizzati e quindi non si ha l'ossidazione del piruvato o dell'acetato in anidride carbonica.

Per ovviare a ciò questi batteri ossidano l'etanolo in acetato, in modo da abbassarne la concentrazione e solo successivamente attivare la sintesi degli enzimi del ciclo TCA e ossidare ulteriormente l'acetato, nel seguente modo:

Acetato + CoA => Acetil-CoA + H2O

Acetil-CoA + 2H2O + 3NAD+ + FAD + ADP + Pi => 2CO2 + CoA + 3NADH-H+ + FADH2 + ATP

Tutto ciò in presenza di ossigeno e ossidando i cofattori redox attraverso la fosforilazione ossidativa, si avrà:

Acetato + H2O + 5/2O2 + 12(ADP + Pi) => 2CO2 + 5H2O + 12(ATP + H2O)

Quindi una bevanda acetica con il tempo tenderà a diventare acquosa, in quanto l'acido acetico viene ossidato, questo processo è molto lento poiché l'ossigeno deve diffondere nel liquido e tutto dipende dall'area della superficie di contatto tra il liquido stesso e l'atmosfera. Se quest'area è piccola l'ossidazione della bevanda in acetica avverrà lentamente e ancora più tempo ci vorrà per renderla acquosa, ciò spiega perché il collo di bottiglie e damigiane è tendenzialmente stretto. Mentre se si vuole produrre dell'aceto bisogna aumentare la superficie di contatto e una volta prodotto va imbottigliato.

Fermentazione acetica dei brettanomyces

Come detto all'inizio oltre agli acetobacter esistono i brettanomyces che sono in grado di fermentare il glucosio in acido acetico. Secondo la seguente formula [1]:

Glucosio + bO2 => aBiomassa + cCO2 + (-0.6b + 0.569)Etanolo + (0.6b + 0.022)Acetato

Quindi come si può osservare nell'immagine accanto [3] si possono avere vari processi metabolici dei brettanomyces e nella parte sottostante si ha un grafico che mostra le condizioni le condizioni in cui avvengono le varie vie metaboliche.

Come con i saccaromyces in condizioni aerobiche  possono utilizzare il TCA per produrre energia e moltiplicarsi. Con il consumo di ossigeno e quindi con l'avvicinarsi delle condizioni anaerobiche la cellula inizia a fermentare etanolo e parallelamente  acido acetico attraverso l'acetaldeidei deidrogenasi.

Acetaldeide + H2O + NADP+ 

=> Acetato + NADPH-H+

Una volta passati dalle condizioni aerobiche a quelle anaerobiche la cellula di brettanomyces inizia la fermentazione alcolica fino al completo consumo degli zuccheri del substrato.

Bibliografia

[1] Aguilar Uscanga M. G., Délia M.-L., Strehaiano P.; Brettanomyces bruxellensis: effect of oxygen on growth and acetic acid production; 14 January 2003 Springer-Verlag 2003;

[2] Kazunobu Matsushita, Hirohide Toyama, Naoto Tonouchi, Akiko Okamoto-Kainuma; Acetic Acid Bacteria; Springer; 2016;

[3] Steensels J., Daenen L, Malcorps P., Derdelinckx G, Verachtert H., Verstrepen K. J.; Brettanomyces yeasts—Fromspoilage organisms to valuable contributors to industrial fermentations; 2015 Published by Elsevier B.V.;

[4] http://lamanna-antonino-chimica.weebly.com/fermentazione-acetica.html;

[5] https://www.tuscany-diet.net/2018/09/01/pentose-phosphate-pathway/.

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Lambic '21 - Invernale

Prima che finisse l'anno, decisi di produrre l'ultima birra a fermentazione spontanea dell'anno. Cogliendo così l'occasione di raccogliere il blend di fermenti invernali.

Per la cotta ho utilizzato:

1.8 kg di malto distico autoprodotto;

1.2 kg di frumento (tenero).

Pausa Acida

Pausa Proteolitica

Pausa Diastatica

Ammostamento torbido, con le seguenti pause:

Pausa acida          a 45° per 10' con l'aggiunta di 2.0l di acqua a 62°;

Pausa proteolitica a 58° per 10' con l'aggiunta di 3.2l di acqua a 100°;

                                      tolgo 0.8l di mosto e porto a 88°;

Pausa diastatica I a 65° per 30' con l'aggiunta di 4.6l di acqua a 100°;

                                       tolgo 3.1l di mosto e porto a 88°;

Pausa diastatica II a 72° per 30' con l'aggiunta di 3.9l di acqua a 100°;

Termine              a 78° per 15' con l'aggiunta di 4.9l di mosto a 88°.

Per l'ammostamento ho utilizzato 14.0l di acqua, mentre per il lavaggio delle trebbie ho utilizzato 9.0l di acqua a 90° per permettere un estrazione maggiore.

Il mosto prebollitura ammontava a 18.0l a 9.6°Br. La bollitura è stata impostata per 60' e la luppolatura mirata ad un valore minore di 10IBU con luppolo fresco:

14.0g di Rubicone 3.0% A.A. a 60'.

Il mosto postbollitura ammontava a 14.0l a 12.2°Br, lasciato a raffreddare per tutta una notte all'aria aperta, in modo da essere inoculato i lieviti presenti nell'aria.

La fermentazione si fece vedere solamente dopo 48 ore, almeno la fase tumultuosa, infatti, nelle 12 ore successive all'inoculo si poteva avvistare qualche bollicina salire in superficie nei fiaschi in cui era stata posta a fermentare.

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Luppolo invecchiato

Essendo stato attratto dal lambic, dalla fermentazione spontanea e tutti i misteri che avvolgevano questo stile quando ne appresi la sua identità anni fa. Decisi, visto come elemento indispensabile per questo stile, di invecchiare un di luppolo, quindi nell'inverno '19 acquistai: 250g di Mittelfruh in coni, benché mi arrivò in plug 45 e fu veramente difficile sformarli; 500g si Saaz sempre in coni, il quantitativo era doppio poiché volevo di anno in anno vedere la sua evoluzione; infine, 250g di Fuggle, questo invece lo acquistati, oltre al fatto che è un luppolo che ho sempre amato, ma soprattutto perché volevo utilizzare un luppolo diverso dai soliti nobili.

Mi feci cucire dei sacchetti in poliestere, con delle zip per avere una buona chiusura. Sistemai tutto in soffitta e lascia che il tempo facesse il suo lavoro.

Quello che posso dire è che il cambiamento a livello olfattivo, nell'arco di un anno c'è stato. Si è passati da fortemente resinoso a floreale, arrivando a quello di fieno.

In aggiunta, quest'anno ho acquistato altro luppolo da invecchiare, 250g di Hersbrucker e 250g di Cascade.

La scelta è ricaduta sul Herbrucker, poiché il Saaz al momento è irreperibile. Mentre l'acquisto del Cascade è puramente sperimentale, con entrambi da quest'anno produrrò un lambic ciascuno ogni anno valutandoli qualitativamente.

La tabella sovrastante riassume l'evolversi della percentuale si alfa acidi nell'arco di 3 anni ad intervalli di 6 mesi. Come avrò tempo produrrò il mio lambic con i luppoli freschi e poi li lascerò invecchiare, per il momento li ho sistemati nei loro sacchetti.

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