Kveik

Con l'arrivo dell'estate chi vuole produrre birra e non ha una camera refrigerata o un fermentatore coibentato, si deve piegare al volere della stagione e smettere di produrre finché le temperature non diventeranno più miti.

In soccorso a ciò, ci viene dall'estremo Nord, con furore, il kveik (si pronuncia k-vaike) un lievito casalingo utilizzato nei paesi scandinavi per la produzione della propria birra di fattoria, illustrato nella foto in basso [4]. Questa parola deriva dal un dialetto norvegese e significa lievito (dove il lievito comune è chiamato gjær),  essa deriva dal norreno kvikk che significa veloce, vigoroso; da questa radice deriva la parola inglese quick con il medesimo significato di veloce.

Questo lievito è costituito principalmente da una miscela dei saccharomyces cerevisiae, anche se esistono alcune varianti che contengono lieviti non-saccharomyces e lattobacilli. Mentre la sua peculiarità è la temperatura di inoculo, compresa tra i 35 e 40°C, e spiega perché si adatti bene a farlo lavora in piena estate. Un altro punto di vantaggio è la scarsa produzione di esteri e quindi un profilo aromatico piuttosto pulito, tra l'altro molte di queste colture sono POF-, quindi non producono fenoli, a differenza di molti dei nostri lieviti ad alta fermentazione. Nonostante ciò, in base al tipo kveik si possono avere profili aromatici di frutta tropicale, come mango e ananas, o citrici, come limone e arancia, o maltati.  Infine, essi presentano un'attenuazione apparente del 75 - 85% e possono tollerare livelli di etanolo tra il 13 e il 16% vol.

Come detto precedentemente il kveik è utilizzato per la produzione di birre di fattoria, chiamate Gårdsøl, dove il termine gårds significa fattoria, mentre øl significa birra e ha la stessa radice ale, queste birre sono pure conosciute con il nome di Maltøl, cioè birra di malto [2]. Il loro processo di produzione può variare di zona in zona, come pure il lievito può cambiare da una fattoria all'altra. Infatti, ognuna di esse ha la propria miscela di fermenti, tramandata di generazione in generazione, ma può avvenire che il proprio kveik sia simile a quello della fattoria limitrofa, poiché in un passato non tanto remoto non si riusciva a far rinvenire la coltura o magari era andata a male, quindi lo si condivideva con qualche fattoria vicina, proprio come faceva una volta con il lievito madre per il pane.

Immagino che ora vi starete chiedendo come veniva conservato il kveik per poter essere utilizzato di anno in anno; semplicemente viene essiccato, su appositi supporti di legno debitamente lavorati per accumulare il fondo di fermentazione. Questi supporti prendono il nome di kveikstokk, e possono avere diverse forme da quella più classica e complessa ad anello di lamine di legno come sopra [3] a quella di semplice a bastone lavorato o forato, come sotto [3]

Il kveik viene principalmente utilizzato nella Norvegia occidentale, e le colture prendono nome dalle fattorie o dalle città da dove provengono come Framgarden o Voss. Questi sono i kveik più facili da reperire sia in forma di coltura pura commercializzata dalle più note case produttrici di lievito, che da coltivatori privati. Esistono altri colture autoctone o landrace in inglese che sono simili al kveik, ma non vengono definiti tali, sono le colture miste provenienti dalla Norvegia orientale conosciuti con il nomi Gong e Berm, dai paesi baltici come Lituania e Lettonia, oppure dalla Ciuvascia, repubblica appartenente alla Confederazione Russa [5].

Geneticamente parlando i saccaromyces cerevisiae che compongono i kveik appartengono a un sottogruppo (aplotipo 1) dei lieviti beer 1 (studio Gillons/White Labs 2016), a questo appartengono i sottogruppi dei comuni lieviti europei come quello belga/tedesco, quello britannico e statunitense. Altra peculiarità genetica sta nel fatto che questi non presentano il gene STA1, responsabile dell'attività diastatica, presente nel gruppo di lieviti beer 2.

Simile al primo sottogruppo ma geneticamente differente ve n'è un secondo (aplotipo 2), il quale non differisce nella fermentazione.

Bibliografia

[1] https://escarpmentlabs.com/blogs/resources/using-norwegian-kveik-old-yeast-new-tricks

[2] http://homebrewingcondor.blogspot.com/2018/08/conservare-il-kveik-su-legno-kveikstokk.html

[3] https://www.brewer-world.com/lalbrew-voss-kveik-a-deep-dive-into-the-history-of-the-ancient-kveik-yeast-strain/

[4] https://www.garshol.priv.no/blog/393.html

[5] https://www.milkthefunk.com/wiki/Landrace_Yeast

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Raccolta lieviti 2023 - Parte prima

Quest'anno ho deciso di avviare una raccolta di lieviti selvatici mensile per tutta la durata del 2023, cercando occasionalmente di sfruttare anche fiori e frutta nella loro stagionalità, oltre alla solita esposizione all'aria aperta.

Gennaio

Come sempre il mio punto di riferimento per la raccolta dei lieviti selvatici è il susino presente nel mio orto, albero che curo ogni anno personalmente. Ad esso ho lasciato appeso per 12 ore un po' di mosto, affinché in questo si depositassero i lieviti naturalmente presenti nell'aria in quella zona.

Essendo ancora in inverno, ho approfittato della presenza di olive ancora sugli alberi come fonte per i mie lieviti. Andando con essi così a concludere la raccolta del mese.

Febbraio e Marzo

In questi due mesi non ho avuto molte occasioni di raccolta lievito, a parte quelle mensili al mio susino d'ispirazione. Infatti, i due mesi sono passati molto velocemente per me e il lievito raccolto a marzo è quello che sembra promettere bene.

Con ciò devo aggiungere che i lieviti raccolti per semplice esposizione a gennaio e a febbraio non hanno mostrato segni di fermentazione a dispetto di quelli per infusione come quelli raccolti dalle olive, mentre da marzo i lieviti si sono dimostrati onnipresenti nell'aria.

Aprile

Durante Aprile il susino sotto il quale raccolgo il solito lievito mensile, è fiorito, inverdendosi, solitamente questa è una delle migliori occasioni per la raccolta. Infatti, due anni fa in questa occasione è nata la mia prima birra a fermentazione spontanea, Libety.

In questo mese l'intera zona in cui abito si riempie dei profumi dei fior d'arancio, e avendone l'occasione, ho raccolto un paio di campioni dagli alberi presenti nei miei terreni. Comunque tutti e tre i fermenti raccolti hanno mostrato segni di vita.

Maggio

 

Maggio è passato veloce come mese, ho raccolto quello mensile.

Giugno

Giugno come sempre è il momento migliore delle mie raccolte, in questo mese il susino matura i frutti e così come lo scorso anno, ho raccolto due campioni uno per esposizione sotto il susino per 12 ore e l'altro per infusione delle susine per 24 ore, anche se a parere mio ne bastano anche 12. Ma non avendo avuto abbastanza tempo per travasare il mosto nei mini fermentatori, le susine sono rimaste in infusione per più tempo.

Questi sono i resoconti delle raccolte nella prima metà di quest'anno, non resta ora che selezionare qualche lievito in purità e produrre della buona birra.

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Fermentazione lattica

Un'altra glicolisi anaerobica è la fermentazione lattica, processo metabolico anaerobico di cui si servono molti microrganismi per ricavare energia dai carboidrati, producendo come sottoprodotto l'acido lattico, ossiacido in grado di inibire molti batteri patogeni e il quale è alla base di ogni bevanda fermentata acida.

C6H12O6 => 2C3H6O3 (+ energia)

Le specie che si servono di questa fermentazione sono soprattutto i batteri lattici (LAB), batteri anaerobici aerotolleranti dell'ordine dei lactobacillales, al quale appartengono i generi dei lactobacillus, dei leuconostoc, degli oenococcus e dei pedioococcus. Degno di nota è anche lo streptococcus thermophilus che insieme al l. delbrueckii subsp. bulgaricus, viene utilizzato nell'industria casearia per la produzione di yogurt.

Fermentazione omolattica

Per fermentazione lattica in senso stretto si intende quella omolattica, nella quale viene prodotto solo acido lattico. I lattobacilli che utilizzano questa via metabolica sono chiamati omofermentativi obbligati e sono i seguenti: l. acidophilus, l. delbrueckii, l. helveticus, l. malis, l. salivarius e s. thermophilus.

Alla base di questa fermentazione vi è la glicolisi, processo di scissione dei carboidrati in piruvato, la cui reazione è stata riassunta sottostante.

Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi => 2Piruvato + 2NADH-H+ + 2ATP + 2H2O

Ma essendo la fermentazione anaerobica, di conseguenza avviene in assenza di ossigeno, come agente riducente del NADH-H+ si utilizza lo stesso piruvato prodotto dalla glicolisi, che viene convertito in lattato, come nell'immagine sopra [3].

Piruvato + NADH-H+ => Lattato + NAD+

Quindi l'intera fermentazione può essere riassunto nel seguente modo:

Glucosio + 2ADP + 2Pi => 2Lattato + 2ATP + 2H2O

Questa fermentazione è molto simile a quella alcolica dei lieviti, dove l'unica differenza sta nei prodotti. Esse vengono raggruppate nel percorso di Embden-Meyerhof, illustrata nell'immagine sottostante [5].

Fermentazione eterolattica

La maggior parte dei lattobacilli, però, quando fermenta non produce solo esclusivamente acido lattico, ma può produrre etanolo, acido acetico, acido formico e tutta una serie di sottoprodotti. Oltre a ciò sono in grado di fermentare sia gli esosi (glucosio, galattosio e fruttosio) che i pentosi (ribosio e xilosio).

Essendo la fermentazione mista, si parla di fermentazione eterolattica, la quale viene utilizzata da due gruppi di lattobacilli: gli eterofermentanti facoltativi, i quali se il substrato di cui si alimentano è ricco di zuccheri, fermentano omolatticamente, altrimenti in carenza di questi tendono a fermentare eterolatticamente, i lattobacilli appartenenti a questo gruppo sono i seguenti: l. casei, l. curvatus, l. paracasei, l. pentosus, l. plantarum, l. sakei; l'altro gruppo di lattobacilli sono gli eterofermentanti obbligati, che danno come prodotto di fermentazione esclusivamente acido lattico, etanolo e/o acido acetico, ad appartenere a questo gruppo sono i seguenti lattobacilli: l. brevis, l. buchneri, l. collinoides, l. fermentum, l. fructivorans, l. hilgardii, l. reuteri.

Il motivo per il quale questi batteri fermentando, producono oltre al lattato anche l'etanolo, risiede nella loro flessibilità di fermentare anche i pentosi. Infatti, nella scissione dei carboidrati non seguono la glicolisi, ma utilizzano la via dei pentosi fosfati unita alla fosfochetolasi

Infatti, una volta formato lo xilulosio-5-fosfato esso viene scisso dalla fosfochetolasi in gliceraldeide-3-fosfato e in acetil-fosfato, che andranno a formare rispettivamente lattato ed etanolo, come nell'immagine sottostante [4].

Viene utilizzata questa via metabolica, poiché gli eterofermentanti obbligatori non hanno l'enzima aldolasi che nella glicolisi scinde il fruttosio-1,6-difosfato in gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiaceto fosfato. Mentre gli eterofermentanti facoltativi utilizzano normalmente la glicolisi e la via dei pentosi fosfati solo in determinati casi. 

• Glucosio + ATP + 2NAD+ + Pi => 

Gliceraldeide-3-fosfato + Acetil-fosfato + ADP + 2NADH-H+ + CO2

• Acetil-fosfato + 2NADH-H+ => Etanolo + 2NAD+ + Pi
• Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP + Pi => Lattato + 2ATP + H2O

Osservando sopra, la reazione di fermentazione eterolattica, convoglia gli NADH-H+ dalla via dei pentosi fosfati per ossidare l'acetil-fosfato e produrre etanolo, mentre quello derivato dalla conversione di gliceraldeide-3-fosfato in piruvato per ossidare questo e produrre lattato. Tutto ciò, partendo dal glucosio, si può riassumere nel seguente modo:

Glucosio + ADP + Pi => Lattato + Etanolo + CO2 + ATP + H2O

Mentre partendo dai pentosi come il ribosio, si ha:

Ribosio + ADP + Pi => Lattato + Etanolo + ATP + H2O

A conti fanti questo tipo di fermentazione dal punto di visto energetico rende pochissimo, una sola molecola di ATP per molecola di glucosio o ribosio. Ma il suo svantaggio è compensato con la possibilità di fermentare pentosi ed avere accesso a fonti energetiche diverse dagli esosi standard.

Fermentazione lattica bifidobatteri

I batteri appartenenti al genere bifidobacterium, fermentano i carboidrati eterolatticamente utilizzando una via di fosfatazione particolare, che produce acido acetico ed acido lattico, come nell'immagine sottostante [1].

Il processo vede due molecole di glucosio, le quali vendono convertite in due di fruttosio-6-fosfato come nella glicolisi, successivamente una di queste viene scomposta in acetil-fosfato ed eritrosio-4-fosfato, il quale viene addizionato all'altra molecola di fruttosio-6-fosfato e scomposta in triosio-fosfato ed eptosio-fosfato. Infine, queste serviranno a produrre due molecole di acetil-fosfato e due di gliceraldeide-3-fosfato.

2Glucosio + 2ATP + 3Pi => 3Acetil-fosfato + 2Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP

Il destino dell'acetaldeide-fosfato è quello di diventare acetato, mentre quello del gliceraldeide-3-fosfato segue lo stesso processo della fermentazione omolattica, quindi diventare inizialmente piruvato e successivamente lattato:

Acetil-fosfato + ADP => Acetato + ATP + H2O

Gliceraldeide-3-fosfato + 2ADP + 2Pi => Lattato + 2ATP + 2H2O

Quindi l'intero processo è molto vantaggioso poiché rende 2.5 molecole di ATP per ognuna di glucosio, come nella seguente reazione globale:

2Glucosio + 5(ADP + Pi) => 3Acetato + 2Lattato + 5(ATP + H2O)

Fermentazione acetica dei lattobacilli

Come detto all'inizio i lattobacilli sono batteri anaerobici aerotolleranti, cioè non riescono ad elaborare l'ossigeno ma ne tollerano la sua presenza. Questo perché non possiedono la catena di trasporto degli elettroni, però possono rigenerare la NADH-H+ riducendo l'ossigeno in acqua o perossido d'idrogeno.

Nell'immagine sopra [2], sono riportare le varie vie metaboliche del l. plantarum e si osserva che il destino del piruvato può essere molteplice.

Via acetica

Il piruvato viene ossidato dall'enzima piruvato ossidasi (POX) in acetilfosfato, il quale a sua volta attraverso l'acetato chinasi (AK) convertito in acetato con produzione di ATP.

Piruvate + H2O + O2 + ADP + Pi => Acetato + CO2 + H2O2 + ATP

Oppure il piruvato decarbossilato dall'enzima piruvato deidrogenasi (PDH) in acetil-CoA, il quale viene fosfato attraverso la fosfotransacetilasi (PTA) in acetilfosfato e produzione di acetato e ATP.

Piruvate + NAD+ + ADP + Pi => Acetato + CO2 + NADH-H+ + ATP

Via aceto-formica

In questo caso il piruvato viene decarbossilato dal piruvato formato liasi (PFL) in acetil-CoA con produzione di formato, e da qui proseguire con la via precedente.

Piruvate + ADP + Pi => Acetato + Formato + ATP

Rigenazione NADH-H+

In presenza di ossigeno da ridurre, ma non disponendo di una catena di trasporto degli elettroni, la NADH-H+ viene rigenerato attraverso due enzimi: la NADH ossidasi (NOX) e la NADH perossidasi (NPR). Le quali utilizzano rispettivamente le seguenti reazioni:

NADH-H+ + O2 => NAD+ + H2O2

NADH-H+ + H2O2 => NAD+ + 2H2O

Questa via metabolica permette a un eterofermetativo di ricavare almeno tre molecole di ATP per molecola di glucosio. Secondo le seguenti reazioni:

Glucosio + 2H2O + O2 + 3ADP + 3Pi => 2Acetato + 2CO2 + H2O2 + 3NADH-H+ + 3(ATP + H2O)

che riassunto diventa:

Glucosio + 2O2 + 3ADP + 3Pi => 2Acetato + 2CO2 + 4H2O + 3(ATP + H2O)

oppure si potrebbe avere:

Glucosio + 2O2 +  3ADP + 3Pi => 2Acetato + Formato + CO2 + H2O2 + 3(ATP + H2O)

Esistono diverse combinazioni di percorsi metabolici, atti a massimizzare la produzione di ATP, ma quelli illustrati sopra in linea di massima sono i più frequenti, da cui si evince che serve ossigeno affinché ciò avvenga, e da cui si capisce che queste non sono vere e proprie fermentazioni, ma come con quella acetica si ha una respirazione.

Bibliografia

[1] Ciani M., Comitini F, e Mannazzu I; Fermentation; Encyclopedia of Ecology, Volume 2, 2013, Pages 310-321;

[2] Quatravaux S., Remize F., Bryckaert E., Colavizza D. and Guzzo J.; Examination of Lactobacillus plantarum lactate metabolism side effects in relation to the modulation of aeration parameters; Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072

[3] https://library.weschool.com/lezione/come-la-cellula-fermenta-zucchero-ad-alcol-e-acido-lattico-4307.html

[4] http://www.biosciencenotes.com/heterolactic-phosphoketolase-pathway/

[5] https://textbookofbacteriology.net/metabolism_3.html

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Fermentazione alcolica

Alla base di una bevanda alcolica vi è la fermentazione alcolica, processo metabolico anaerobico di cui si servono molti microrganismi per ricavare energia dai carboidrati, producendo come sottoprodotto etanolo, alcole semplice il quale se prodotto oltre una certa concentrazione può rivelarsi mortale anche per essi.

C6H12O6 => 2CO2 + 2C2H6O + (energia)

Le specie che si servono di questa fermentazione sono soprattutto i lieviti, funghi appartenenti alla famiglia dei saccharomycetaceae oppure al genere dei schizosaccharomices. E oltre ai lieviti esistono alcuni batteri che hanno scelto questa via metabolica come lo zymomonas mobilis.

Come con tutti i processi metabolici si parte dalla glicolisi, processo enzimatico che scinde i carboidrati in piruvato. La cui reazione è riassunta sottostante:

Glucosio + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi => 2Piruvato + 2NADH-H+ + 2ATP + 2H2O

Essendo la fermentazione anaerobica e di conseguenza avviene in assenza di ossigeno, come agente riducente del NADH-H+ si utilizza lo stesso piruvato prodotto dalla glicolisi.

In questo processo il piruvato viene inizialmente decarbossilato, per avere l'acetaldeide la quale a sua volta viene poi ridotta in etanolo. Questa reazione può essere osservata nell'immagine sovrastante [4] ed è riassunta con la seguente espressione:

Piruvato + NADH-H+ => Etanolo + CO2 + NAD+

Quindi la fermentazione alcolica si può riassumere con la seguente reazione:

Glucosio + 2ADP + 2Pi => 2Etanolo + 2CO2 + 2(ATP + H2O)

Si può dire allora, che così come la respirazione viene chiamata glicolisi aerobica, la fermentazione alcolica e le altre, possono rientrare nella categoria di glicolisi anaerobica. Nella quale per ogni molecola di glucosio si ricavano solo due molecole di ATP, più un sottoprodotto parzialmente ossidato del glucosio.

Va anche detto che i lieviti sono organismi anaerobici facoltativi, cioè in base alle condizioni ambientali possono passare dal ricavare l'energia dal loro substrato attraverso la respirazione o attraverso la fermentazione. Ma allora perché spesso favoriscono la seconda che da due molecole di ATP rispetto la prima che ne potrebbe dare 38 per ogni molecola di glucosio? 

Questa scelta è causata dall'effetto Crabtree, infatti, se il substrato di crescita dei nostri microrganismi supera una certa soglia di concentrazione di glucosio, 0.25g/l nel caso del s. cerevisieae, essi tendono a reprimere la respirazione cellulare per favorire la fermentazione. Ciò è causato dalla repressione del complesso citocromo a-a3 [2], il quale si trova nella parte terminale della catena di trasporto degli elettroni, e di conseguenza non permettendo la riduzione dell'ossigeno e la rigenerazione della NADH-H+.

L'effetto Crabtree avviene gradualmente ed è reversibile, cioè il lievito mentre fermenta respira pure, perché non tutti i citocromi vengono repressi e una volta che la concentrazione di glucosio si abbassa esso ricaverà energia esclusivamente respirando sempre se c'è abbastanza ossigeno. Quest'ultimo gioca un ruolo fondamentale, infatti, la sua concentrazione può inibire la fermentazione per favorire la respirazione e questo fenomeno è conosciuto come effetto Pasteur, il tutto è schematizzato nell'immagine sovrastante [5].

Fermentazione glicero-piruvica

Come detto all'inizio, se l'etanolo è presente in una certa quantità, esso si può dimostrare dannoso per i nostri microrganismi fermentatori. A risentirne maggiormente è l'enzima alcool deidrogenasi, responsabile della conversione dell'acetaldeide in etanolo attraverso la riduzione della NADH-H+.

Avviene così la fermentazione gliceropiruvica [3], che vede un intermedio della glicolisi prendere una strada diversa rispetto al solito. Il diidrossiacetone fosfato normalmente verrebbe convertito in gliceraldeide-3-fosfato dall'enzima trioso fosfato isomerasi e produrre piruvato (per una maggiore comprensione guardare lo schema della glicolisi del post sulla respirazione cellulare). Questo passaggio viene omesso perché la NADH-H+ prodotta con il piruvato, non viene rigenerata sull'acetaldeide, ma si rigenera sul diidrossiacetone fosfato. Così facendo si produce glicerol-3-fosfato, il quale andrà a produrre a sua volta glicerolo.

Quindi avremo tre passaggi, riassumibili con le seguenti reazioni:

Glucosio + 2ATP => Gliceraldeide-3-fosfato + Diidrossiacetone fosfato + 2ADP

Gliceraldeide-3-fosfato + NAD+ + 2ADP + Pi => Piruvato + NADH-H+ + 2ATP + H2O

Diidrossicetone fosfato + NADH-H+ + H2O => Glicerolo + NAD+ + Pi

Le quali sommate danno la seguente reazione globale:

Glucosio => Glicerolo + Piruvato

Il glicerolo prodotto viene espulso dalla cellula, questo essendo polialcole darà dolcezza alla bevanda alcolica. Mentre il piruvato può prendere diverse strade per essere smaltito, schematizzato sopra [3], producendo tutta una serie di sotto prodotti come:

Piruvato => Acetaldeide + CO2

2Piruvato => Acetolattato + CO2

Acetolattato => Diacetile + CO2

Acetolattato => Acetoino + CO2

Acetoino + NADH-H+ <=> 2,3-butandiolo + NAD+

Acetoino + NAD+ <=> Diacetile + NADH-H+

Questi sottoprodotti contribuiscono al bouquet di aromi delle bevande alcoliche e vengono prodotti in base alla disponibilità di NAD+ o di NADH-H+. L'acetaldeide o etanale (C2H4O) come visto in precedenza è un prodotto intermediario della fermentazione prima di essere convertita in etanolo, e presenta un odore fruttato. L'acetolattato (C5H8O4) è un intermedio prodotto dalla fusione di due molecole di piruvato e che tende a ossidarsi e decarbossidarsi spontaneamente in diacetile oppure essere decarbossidata enzimaticamente in acetoino. Il diacetile (C4H6O2) è un dichetone che presenta un aroma di burro, che può tendere al caramello se presente in alte quantità, viene prodotto dal s. pastorianus, se lavora a temperature troppo basse. L'acetoino o acetoina (C4H8O2) è un ossichetone,  presenta un odore burroso che si avvicina a quello delle mandorle. Il 2,3-butandiolo (C4H10O2) è un polialcole, che presenta un odore tendente al burroso o meglio al "pannoso", comunque minore del diacetile.

Un altro sottoprodotto della fermentazione gliceropiruvica del s. cerevisiaea è l'acido succinico (C4H6O4), un acido bicarbossilico generato dalla modifica del ciclo TCA, come si può vedere nell'immagine sopra [1]. E il tutto può essere riassunto con la seguente reazione:

Piruvato + CO2 + 2NADH-H+ => Succinato + H2O + 2NAD+

Questo acido è molto importante per la regolazione del pH, contribuendo in parte all'acidità della bevanda fermentantata. Comunque tutte le molecole elencate sono prodotte in piccole quantità e permettono di dare complessità alla bevanda fermentata, infatti, senza di esse, i vini e le birre sarebbero tutti sensorialmente più spenti.

La via di Entner-Doudoroff

Come detto in precedenza, oltre ai lieviti vi sono i batteri del genere zymomonas in grado di fermentare gli zuccheri e produrre etanolo.

Solo che questo genere non è in grado di scindere i carboidrati attraverso la glicolisi e come si può osservare nell'immagine sopra [6], utilizzando la via di Entner-Doudoroff per la produzione di acido piruvico da fermentare, questa via metabolica parte dal glucosio-6-fosfato il quale viene ossidato inizialmente in acido 6-fosfogluconico e successivamente disidrato in acido 2-cheto-3-deossi-6-fosfogluconico. Questo prodotto attraverso l'enzima aldosi viene scisso in acido piruvico e in gliceraldeide-3-fosfato.

Ora il primo segue la normale fermentazione alcolica il secondo viene convertito in acido piruvico e poi in etanolo. L'intero processo da la seguente reazione:

Glucosio + ATP + 2ADP + Pi + 2NAD+ + 2NADH-H+ => 

2Etanolo + 2CO2 + ADP + 2ATP + 2NADH-H+ + 2NAD+ + H2O

La quale si può riassumere nel seguente modo:

Glucosio  + ADP + Pi => 2Etanolo + 2CO2 +  ATP + H2O

Questa fermentazione è sicuramente più svantaggiosa rispetto quella attuata dai lieviti, in quanto energeticamente rende una molecola di ATP per ognuna di glucosio, ma utilizza meno enzimi per la scissione di quest'ultimo, rendendola una via più pratica.

Bibliografia

[1] Daojiang Yan, Caixia Wanga, Jiemin Zhou, Yilan Liu, Maohua Yang, Jianmin Xing; Construction of reductive pathway in Saccharomyces cerevisiae for effective succinic acid fermentation at low pH value; Bioresource Technology 156 (2014) 232–239;

[2] Tomoko Ohnishi; Mechanism of electron transport and energy corservation in the site I region of the respiratory chain; Biochimica et Biophysica Acta, 301 (1973) 105-128;

[3] Victoria Moreno-Arribas M., Carmen Polo M.; Wine chemistry and biochemistry;  Springer Science+Business Media, LLC 2009;

[4] https://commons.wikimedia.org/

[5] https://oncohemakey.com/the-metabolism-of-cell-growth-and-proliferation/

[6] https://textbookofbacteriology.net/metabolism_3.html

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Respirazione cellulare

La forma più efficiente che esista al mondo per ricavare energia dai carboidrati è la respirazione cellulare. Essa è un processo esotermico di ossidoriduzione, cioè che produce energia e quindi anche calore, attraverso l'ossidazione di una sostanza (glucosio in anidride carbonica) e la riduzione di un altra (ossigeno in acqua).

C6H12O6 + 6O2 => 6CO2 + 6H2O + (energia)

Nel mondo microscopico ci sono i lieviti, che generalmente possono ricavare energia per via aerobica con la respirazione, ma solo in determinate condizioni. Quindi prima di introdurre la fermentazione ci tenevo a spiegare questo processo, sperando di non appesantire troppo il contenuto del blog.

Glicolisi

Alla base della respirazione e di quasi tutte le fermentazioni vi è la glicolisi, una serie di reazioni enzimatiche atte a scindere i carboidrati come glucosio e fruttosio in piruvato.

L'immagine sopra [2], mostra tutti i passaggi enzimatici dell'intero processo di glicolisi, si può notare che il secondo enzima, isomerizza il glucosio in fruttosio, ciò significa che il processo come detto prima può partire direttamente dal fruttosio saltando questo passaggio. Mentre tutto il processo vede una serie di reazioni che coinvolgono la produzione di ATP (adenosintrifosfato), molecola che fa da vettore energetico all'interno della cellula, insieme a tutte una serie di sostanze usate per ossidare il glucosio.

L'intero processo può essere riassunto nella seguente reazione:

Glucosio + 2ATP + 2NAD+ + 4ADP + 2Pi = 2Piruvato + 2ADP + 2NADH-H+ + 4ATP

che semplificando si ha:

Glucosio + 2NAD+ + 2ADP  + 2Pi => 2Piruvato + 2NADH-H+ + 2ATP

Ciclo di Krebs

Il ciclo di Krebs o ciclo dell'acido citrico (TCA  TriCarboxylic Cycle) è un processo ciclico enzimatico atto a massimizzare il rendimento energetico del piruvato. Esso inizialmente viene decarbossilato e legato al CoA (coenzima A), per produrre anidride carbonica e acetil-CoA. Il tutto grazie al complesso enzimatico del piruvato deidrogenasi (PDH). L'acetil-CoA serve per poter trasportare il radicale acetilico all'interno dei mitocondri, le centrali energetiche delle cellule, e avviare il ciclo di Krebs.

Piruvato + CoA + NAD+ => Acetil-CoA + CO2 + NADH-H+

Sopra [1], si può osservare l'intero processo di ossidazione del piruvato in anidride carbonica del ciclo di Krebs. Anche in questo caso vi sono una serie di reazioni che permettono la produzione di ATP e di altre componenti, il cui destino verrà rivelato più in avanti.

L'intero processo può essere riassunto con la seguente reazione:

Acetil-CoA + 3H2O + 3NAD+ + FAD + ADP + Pi + CoA => 

2CO2 + H2O + 2CoA + 3NADH-H+ + FADH2 + ATP

La quale una volta semplificata diventa:

Acetil-CoA + 2H2O + 3NAD+ + FAD + ADP + Pi => 2CO2 + CoA + 3NADH-H+ + FADH2 + ATP

Catena di trasporti degli elettroni

Come si è potuto notare precedentemente, la glicolisi e il ciclo di Krebs oltre a produrre ATP, producono NADH-H+ (nicotinammina adenin dinucletide ridotta) e FADH2 (flavina adenina dinucleotide ridotta). Queste sono dei cofattori redox e vengono impiegate per deidrogenare e una volta prodotte devono essere rigenerate attraverso la loro ossidazione, con la riduzione dell'ossigeno in acqua e produzione di ATP.

Questo processo, illustrato a sinistra [1]. prende il nome di catena di trasporto degli elettroni, poiché costituita da una serie di coenzimi che attraverso uno scambio di elettroni e ioni H+, riescono a convertire questa energia in carburante per la cellula.

Infatti, per la NADH-H+ avremo:

NADH-H+ + 1/2O2 + 3ADP + 3Pi 

=> NAD+ + 3ATP + 4H2O

Mentre per la FADH2 avremo:

FADH2 + 1/2O2 + 2ADP + 2Pi 

=> FAD + 2ATP + 3H2O

Poiché il processo funge da meccanismo di produzione dell'ATP, esso prende anche il nome di fosforilazione ossidativa, visto che l'energia data dall'ossidazione della NADH-H+ in NAD+ e della FADH2 in FAD viene utilizzata per la fosforilazione dell'ADP in ATP.

Conclusione

Tirando le somme avremo che la respirazione cellulare (glicolisi e ciclo di Krebs) può essere riassunta inizialmente con la seguente equazione:

Glucosio + 2CoA + 4H2O + 10NAD+ + 2FAD + 4ADP + 4Pi

=> 6CO2  + 2CoA + 10NADH-H+ + 2FADH2 + 4ATP + 2H2O

La cui formula includendo la catena di trasporto degli elettroni diventa:

Glucosio + 4H2O + 10(NAD+ + 3ADP + 3Pi +1/2O2) + 2(FAD+ 2ADP + 2Pi +1/2O2) + 4ADP + 4Pi

=>

 6CO2  + 10(NAD+ 3ATP + 4H2O) + 2(FAD + 2ATP + 3H2O) + 4ATP + 2H2O

Che può essere semplificata e riassunta in:

Glucosio + 6O2 + 38(ADP + Pi) => 6CO2 + 6H2O + 38(ATP + H2O)

Quindi la respirazione non fa che scindere gli atomi di carbonio del glucosi e ossidarli in presenza di ossigeno, ricavandone energia, infatti, uno dei nomi alternativi di tutto questo processo è glicolisi aerobica, dove una molecola di glucosio può rendere fino a 38 molecole di ATP, benché non sempre la resa è assoluta e in media si hanno 36 molecole di ATP.

Bibliografia

[1] Biochimica della fermentazione alcolica e vie metaboliche dei lieviti enologici;

[2] https://commons.wikimedia.org/

Le informazioni presenti su questo blog sono a scopo informativo, quindi mi esento da qualsiasi responsabilità per i danni che potreste causare.

Selezione lieviti del '22

Dopo aver sperimentato la fermentazione spontanea in tutte le sue forme, raccogliendo lieviti in tutte la quattro stagioni, è giunta l'ora di selezionare monocolture e pluricolture di lieviti per la mia attività brassicola. Questo perché vorrei produrre delle birre in stile saison o ale, più pulite senza la presenza del funky dato da lieviti non-saccharomyces selvatici.

Durante tutto l'anno ho tenuto in vita i blend stagionali, conservandoli in frigo e rinfrescandoli di volta in volta con mosto fresco. Nonostante tutto siccome siamo in primavera, con temperature ottimali per la coltivazione di lieviti, ho utilizzato anche del blend fresco primaverile.

Armato così di lieviti ed attrezzatura da laboratorio nel mese di aprile iniziai la selezione.

Preparai 500.0ml di terreno di coltura composto da mosto luppolato a 10.0°Br e 10IBU e 4.0g di agar agar, il tutto autoclavato a 121.0°C per 20 minuti. Le piastre di petri, le provette e i puntali della micropipetta furono pure autoclavati come il terreno.

Blend invernale

Primo ad essere stato sottoposto alla selezione è il blend invernale, cioè quello relativamente più fresco, raccolto a cavallo tra '21 e '22. Riportando in sospensione il lievito e stimando che la quantità di cellule vive ammontasse intorno 10^8 ufc/ml, ne feci sei piastrature. Tre inoculate 1000 ul a con una diluizione 1:10^7 ed altre tre sempre con 1000 ul con una diluizione di 1:10^8.

Dopo 48 ore sulle prime piastre contai tra le 5 e 6 colonie, mentre sulle secondo tra le 2 e le 3 colonie. Di conseguenza le mie stime erano sbagliate in quanto il mio blend aveva intorno alle 5x10^7 ufc/ml; in compenso raccolsi una colonia per piastra andando a selezionare le mie sei monocolture di lievito invernale.

Blend primaverile

L'altro blend sottoposto alla selezione è quello primaverile, raccolto negli ultimi giorni. La procedura è stata identica a quella precedente. Solo che dopo 48 ore sulle piastre a diluizione 1:10^7 contavo tra le 13 e le 15 colonie, di conseguenza il mio blend presentava 1.4x10^8 ufc/ml, mentre le piastre a inoculate con una maggiore diluzione le restituirono una media di 2 colonie a piastra.

Delle prime raccolsi tre monocolture per piastra andando così a selezionare nove lieviti primaverili.

Epilogo

Tutti i lieviti raccolti sono stati inoculati inizialmente in 10.0ml di mosto luppolato a 10.0°Br, successivamente dopo 48 ore in 100.0ml di mosto luppolato a 12.0°Br. Dopo 24 ore metà di esso è stato inoculato 500.0ml di mosto luppolato a 12.0°Br e il resto conservato.

Infine, questi lieviti sono stati inoculati delle "mini cotte", che consistevano il cotte da 24.0l divise in cinque fiaschi di volume complessivo da 5.0l, riempiti con 4.8l di mosto a 12.0°Br e 20IBU, fatto con metà malto pilsner e metà frumento crudo. Ciò affinché potessi identificare lieviti POF+.

Il risultato finale è stato che i lieviti invernali presentavano un profilo fenolico più basso di quelli primaverili, quindi adatti alla produzione di ale mentre quelli primaverili più adatti alle wit. Tutti con un attenuazione apparente media del 70.0% e fortemente flocculanti.

Blend estivo

Successivamente con l'arrivo dell'estate avviai la raccolta di lieviti dalla frutta. Nella terza decade di giugno raccolsi il blend etichettato come L1.1 ed L1.2; il primo mettendo in infusione 300.0g di susine giugniche in 800.0ml di mosto a 12.0°Br e 20IBU, mentre il secondo consisteva di 800.0ml di mosto, con le stesse caratteristiche del precedente, lasciato per 10 ore appeso ad un ramo della stessa susina da cui sono stati raccolti i frutti per L1.1.

Susina giugnica, con L1.1

Susina agostina

Sorte simile avvenne ad agosto per i lieviti L2, L3 e L4. Il primo fu raccolto mettendo in infusione in 200.0ml di mosto a 12.0°Br e 20IBU, 80.0g circa di susine agostine; il secondo invece con dei fichi, mentre il terzo con dei ficodindia. 

Sopra di possono osservare due dei blend in infusione con i frutti prelevati in giro, mentre a destra, la maestosità del fico bianco dal quale arriva L3. L2 ed L4 si trovano in orti situati a circa 1.0Km dalla mia abitazione e altrettanto distanti tra loro, mentre L3 a 200.0m da L2. Molto probabilmente, riclassificherò L2 ed L3 come, L2.1 ed L2.2; mentre L4 come L3.

 

Inizia con la selezione dei primi lieviti, tentai di farli cresce su un terreno tinto con del blu di bromotimolo, ma per fare ciò dovetti abbassare il pH del mosto utilizzato da 5.6 a 7.0. Utilizzai questo indicatore per poter distinguer lieviti saccharomyces da quelli non, basandomi sul fatto che in condizioni aerate producono elevate quantità di acido acetico. I risultati furono molto deludenti in quanto non crebbe nulla.

Il secondo tentativo fu di utilizzare un semplice terreno composto da 500.0ml di mosto a 10.0°Br e 10IBU, con l'aggiunta di 8.0g di agar agar, il tutto autoclavato per 20 minuti. Andai a così a fare sei piastratura per il blend L1.1, tre inoculate con 100ul con diluizione 1:10^6 e tre inoculate con 100ul ma con diluizione 1:10^7. Lo stesso feci con L1.2.

Anche con il secondo tentativo fu un insuccesso, molto probabilmente avrei dovuto rinfrescare i lieviti molto più spesso di quanto ho fatto, in quanto si sono sviluppate sporadicamente qualche colonia qua e la. Con l'anno nuovo ritenterò.

Le informazioni presenti su questo blog sono a scopo informativo, quindi mi esento da qualsiasi responsabilità per i danni che potreste causare.